Nelle differenti forme in cui si sono presentate le Tartarughe Ninja, il ruolo e le caratteristiche di molti personaggi sono stati talvolta modificati, anche radicalmente. Pertanto, la seguente descrizione si riferisce alla storia originale di Eastman e Laird. In tale serie, tutte le maschere delle tartarughe erano rosse. A partire dal cartone animato dell'87 ed in tutti i media successivi, ognuno di loro indossa una maschera di colore differente.
Schema riassuntivo: iniziale del nome, colore, arma.
Leonardo: soprannominato Leo, è il fratello maggiore e leader delle tartarughe mutanti, nonché il più disciplinato, spirituale, serio e responsabile. È un abile guerriero che ha fatto del Bushido la sua guida morale e spirituale. La sua priorità principale è aiutare i suoi fratelli a diventare i migliori ninja possibili. A causa della sua leadership, è spesso confrontato con il carattere ribelle di Raffaello. Indossa una maschera blu ed è un maestro nell'uso della katana. Ama la filosofia, leggere, affilare le spade e meditare. Odia le ingiustizie e chi non rispetta le regole.
Raffaello: soprannominato Raph, è il fratello secondogenito e la testa calda del gruppo. È la tartaruga irascibile, sarcastica, testarda, determinata e aggressiva, spesso guidata dalle sue forti emozioni. Ha un forte desiderio di indipendenza e spesso dimostra animosità con Leonardo per la sua leadership e i suoi metodi contrastanti. Nonostante la sua irruenza, ha un animo nobile e un grande coraggio. Porta una maschera rossa ed è un maestro nell'uso dei pugnali sai. Ama allenarsi e combattere. Ha paura delle scolopendre e degli scarafaggi. Il suo carattere irascibile tende ad avere la meglio su di lui, ma vuole apertamente bene ai suoi fratelli, suo padre e ai suoi alleati. È quello che più tiene alla giustizia e il primo a divenire amico di Casey Jones.
Donatello: soprannominato Donnie, è il fratello terzogenito, nonché il più intelligente e spesso il più gentile delle tartarughe. Intellettuale, tenta spesso di raggiungere i suoi obiettivi attraverso la scienza e la tecnologia piuttosto che attraverso la violenza e quindi inventa spesso gadget e veicoli. Oltre ad essere il fratello più calmo e riservato, è anche il secondo in comando di Leonardo. Indossa una maschera viola ed è un maestro nell'uso del bastone bō. È innamorato pazzo di April, di cui è però innamorato anche Casey, quindi spesso è quello che va meno d'accordo con il ragazzo.
Michelangelo: soprannominato Mikey, è il fratello minore. Considerato il meno disciplinato e più amante del divertimento del gruppo, coglie qualsiasi occasione per sdrammatizzare i combattimenti con battute scherzose. Di solito è il più agile e veloce dei fratelli, ha buona conoscenza delle tecniche ninjutsu ed è un maestro con i nunchaku. Indossa una maschera arancione. Tipico adolescente stereotipato, ha uno spirito libero ed esprime chiaramente il suo amore per la pizza e il cinema, mentre non ama il silenzio e annoiarsi. A causa della sua giovane età e al fatto di essere il minore del gruppo, è anche il più diretto e libero tra i fratelli, perchè non ha mai avuto le loro stesse responsabilità. Tuttavia, per il suo carattere, è anche quello meno preso sul serio, che anche quando ha un'idea che potrebbe sembrare buona tende a essere sminuito dagli altri. È un grande amico (nonché primo a conoscerlo e a farci amicizia) di Leatherhead.
Maestro Splinter: anziano ratto mutante, padre adottivo e maestro delle tartarughe. Ha istruito Leonardo e i suoi fratelli fin dalla loro infanzia per farne abili guerrieri e giustizieri. Oltre ad essere eccezionale nelle arti del combattimento, si interessa molto di filosofia orientale. È dotato di un'innata capacità nel leggere il linguaggio del corpo e nel prevederne i movimenti. Ha un eccezionale controllo sulle proprie sensazioni ed emozioni quali il dolore fisico e la paura. Ama i suoi "figli" allievi e meditare. Odia Shredder e tutto ciò che ha a che fare con lui.
April O'Neil: è la giovane assistente dello scienziato Baxter Stockman tratta in salvo dalle tartarughe mutanti. Da allora è divenuta la loro prima collaboratrice umana, che funge spesso da tramite fra la squadra di Leonardo e la società umana.
Casey Jones: era dei corpi speciali e poi divenuto un irrequieto vigilante assetato di giustizia, condivide una stretta alleanza con Raffaello e con le altre tartarughe, che aiuta spesso anche in battaglia. Non utilizza armi vere e proprie, preferendo coprirsi il volto con una maschera da hockey e brandire mazze sportive. Abilissimo nel corpo a corpo, su sua richiesta viene anche allenato da Raffaello ottenendo in pochissimo tempo grandi risultati, diventando un ottimo esperto di arti marziali. È il migliore amico di Raffaello, ama combattere, allenarsi, mangiare, le moto, l'hockey e il baseball. Odia i criminali e le multe per eccesso di velocità. Ha tuttavia una rivalità in amore con Donatello, dato che entrambi sono (in quasi tutte le versioni) innamorati di April O'neil.
Shredder: è l'arcinemico delle Tartarughe Ninja. Nutre una profonda invidia verso Leonardo per la sua abilità nel combattimento, riuscendo comunque a sconfiggerlo per la scarsa abilità e agilità. La sua vera identità è quella del magnate giapponese Oroku Saki, e comanda una delle più potenti organizzazioni criminali a livello globale. È un abile, astuto e malvagio guerriero e conosce a fondo le vie del ninjitsu, ma antepone all'onore la soddisfazione dei suoi desideri materiali. Viene sconfitto e ucciso dalle Tartarughe al fine di evitare la chiusura della sua organizzazione.
Clan del Piede: sono esperti combattenti addestrati alle pratiche marziali, compongono il Clan del Piede e l'esercito clandestino che governa il crimine organizzato di New York. Benché apparentemente legati al Bushido, operano spesso come mercenari al soldo del miglior offerente. Vengono talvolta rappresentati come robot.
Karai/Miwa: figlia adottiva e braccio destro di Shredder, ne è il discepolo prediletto. Nonostante Karai sia una ferma sostenitrice del codice d'onore, ha più volte dimostrato di essere maggiormente interessata alla pietà piuttosto che alla vendetta. Si ribella da Shredder e dal Clan del Piede per allearsi con le Tartarughe e i suoi amici e finalmente come mezzo anti-eroe e mezzo anti-cattivo con il nome di Miwa potrà vendicarsi. In Teenage Mutant Ninja Turtles - Tartarughe Ninja è la figlia biologica di Hamato Yoshi, divenuto poi Splinter.
Bebop e Rocksteady: due criminali al servizio di Shredder che in seguito a un esperimento sono stati trasformati rispettivamente in un uomo-facocero e in un uomo-rinoceronte. Quando erano in forma umana, facevano parte di una squadra di teppisti di New York, arruolati in seguito da Shredder per fermare April O'Neil nei suoi reportage di attività criminali nella metropoli; il processo di trasformazione li ha resi più grandi e forti, ma egualmente inetti a combattere il quartetto di tartarughe, e infatti loro sono considerati la linea comica del Clan del Piede.
Kraang: sono alieni composti da cellule cerebrali, simili a grossi cervelli muniti di volto e tentacoli. Un incidente ne ha costretti alcuni a vivere sulla Terra, in particolari esoscheletri mimetici.
Baxter Stockman: è un geniale scienziato, esperto di tecnologie avanzate e pioniere della robotica. Ha tentato di uccidere la sua assistente, April O'Neil, per difendere il segreto di alcuni affari illeciti, ma è stato sconfitto dalle Tartarughe Ninja.
Hamato Yoshi: prima di subire la mutazione, il Maestro Splinter era un comune ratto domestico ed apparteneva al Maestro Yoshi, abile esperto di ninjitsu, che venne poi assassinato da Oroku Saki, motivo per cui le Tartarughe Ninja e il loro sensei hanno giurato vendetta. In alcune versioni il suo personaggio viene fuso con quello di Splinter.
Leatherhead: un alligatore rimasto, come le tartarughe, contaminato dal liquame radioattivo. Vive anch'egli nelle fogne di New York, dove ha subito la fortuita mutazione e collabora talvolta con le quattro Tartarughe Ninja.
Fugitoid: ciò che resta del Professor Honeycutt, uno scienziato del pianeta coloniale D'Hoonib, che è stato trasferito in un corpo meccanico. Viene difeso dalle Tartarughe Ninja quando i Triceraton decidono di catturarlo per ottenere i progetti di una spaventosa arma.
Recky: sono dei robot costruiti da Donatello. Appaiono per la prima volta durante la battaglia finale contro Shredder e i suoi scagnozzi. Distruggono una parte del rifugio, facendo in modo che la battaglia si estendesse anche per il resto di New York, poi però vengono tutti distrutti dall'esplosione delle fogne.
Chaos: è una strana creatura mutante salvata dalle tartarughe e da April dalle grinfie del Barone Draxum durante il primo episodio, diventando in seguito l'animale da compagnia della ragazza. Ha il potere di teletrasportarsi, ma facendolo per troppe volte rischia di rimanere senza energie. È apparso solo e unicamente nella serie animata reboot Rise of the Teenage Mutant Ninja Turtles - Il destino delle Tartarughe Ninja e nel film d'animazione Tartarughe Ninja - Caos mutante.
Hun: è un uomo dalla muscolatura molto sviluppata, con capelli biondi e occhi neri ed è l'unico del Clan del Piede in grado di affrontare le tartarughe da solo e a mani nude. È anche appartenente al gruppo dei dragoni purpurei.
Guardie d'Elite: i quattro migliori soldati del Clan del Piede ricevono il ruolo di Guardie d'Elite, il cui scopo è quello di proteggere Shredder in battaglia. Svolgono anche un ruolo di combattenti scelti.
Triceraton: definiti talvolta come gli alieni più crudeli dell'Universo, hanno l'aspetto di triceratopi umanoidi, arcinemici dei Kraang. La loro società è ispirata a quella dell'antica Roma e le uniche virtù da loro riconosciute sono l'onore e il coraggio.
Bishop: è uno scienziato che lavora per il governo. Lo si vede per la prima volta nella serie animata del 2003 dopo l'attacco dei Triceraton. Sembra che conosca molto bene le tartarughe.
Barone Draxum: è uno spietato e tirannico mutante alchimista con lo scopo di tramutare tutti gli umani in mutanti. Il personaggio è l'antagonista principale nella prima stagione della serie animata reboot Rise of the Teenage Mutant Ninja Turtles - Il destino delle Tartarughe Ninja, tuttavia diventa semi-alleato delle tartarughe dopo che l'hanno sconfitto.
Usagi Yojimbo: coniglio antropomorfo ronin di un Giappone del XVII secolo alternativo. Amico delle tartarughe in diverse versione della storia.
