EcoRV
| EcoRV | |
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| Proteina | |
| PDB | 1AZ0 |
EcoRV (pronuncia: eco R cinque) è una endonucleasi di secondo tipo isolata da specifiche linee di Escherichia coli. Spesso l'enzima viene anche definito Eco32I.
In biologia molecolare, EcoRV è un enzima di restrizione comunemente utilizzato, in grado di produrre tagli orizzontali ed estremità non coesive. Esso riconosce la sequenza palindromica 5'-GAT|ATC-3', operando un taglio presso la linea orizzontale. La sequenza complementare è dunque 3'-CTA|TAG-5'.
Struttura
[modifica | modifica wikitesto]La struttura di EcoRV è stata definita attraverso cristallografia a raggi X, ad ottenerne la conformazione in associazione alla sequenza bersaglio.[1]
L'interno dell'enzima (core) consiste di un foglietto β composto da cinque filamenti fiancheggiato da α eliche. Questo core è conservato in tutte le endonucleasi di secondo tipo. Esso presenta anche un sottodominio NTD di dimerizzazione, formato da una breve α elica, un foglietto a due filamenti antiparalleli ed una lunga α elica. Questo sottodominio è presente solo in EcoRV e PvuII.[2]
Meccanismo di azione
[modifica | modifica wikitesto]Come EcoRI, anche EcoRV forma un omodimero in soluzione prima di legare e tagliare la sua sequenza specifica di DNA.[3] Dapprima l'enzima si lega debolmente ad un sito non specifico di DNA, quindi si sposta casualmente lungo il DNA alla ricerca del sito,[2] che riconosce con estrema specificità.
Il legame di questo enzima induce un cambiamento conformazionale nel DNA, inducendone un piegamento di circa 50°. L'effetto di tale piegamento è una maggiore accessibilità del solco minore ed una compressione di quello maggiore, con conseguenze sul legame fosfodiestere, che viene avvicinato al sito attivo dell'enzima e tagliato. Il taglio dunque non richiede la presenza di ATP.[2] EcoRV è l'unico enzima di restrizione noto per generare un cambiamento conformazionale nel DNA di questa entità.[2]
Utilizzi
[modifica | modifica wikitesto]EcoRV è spesso utilizzato, in soluzione in albumina di siero bovino, per operare un subclonaggio, inserendo cioè un frammento genico d'interesse all'interno di un vettore come un plasmide.
Note
[modifica | modifica wikitesto]- ^ Struttura cristallina di EcoRV: codice PDB [1].
- ^ a b c d Pingoud A, Jeltsch A, Structure and functions of type II restriction endonucleases, in Nucleic Acids Research, vol. 29, n. 18, 2001, pp. 3705-3727, PMID 11557805.
- ^ Bitinaite J, Wah D A, Aggarwal A K, Schildkraut I, Structure FokI dimerization is required for DNA cleavage, in Proc Natl Acad Sci USA, vol. 95, n. 18, 1998, pp. 10570-10575, PMID 9724744.
Voci correlate
[modifica | modifica wikitesto]- EcoRI, un altro enzima di restrizione proveniente da Escherichia coli.