Le esonucleasi sono enzimi che idrolizzano il DNA iniziando la loro azione da un'estremità libera e procedendo gradualmente lungo la catena polinucleotidica, liberando un singolo nucleoside monofosfato per volta.
Questi enzimi possono iniziare l'idrolisi dei legami fosfodiesterici dall'estremità OH-3' libera della catena polinucleotidica e procedere, quindi, in direzione 3'→5', oppure dall'estremità P-5' e procedere in direzione 5'→3'.
Molte DNA polimerasi, come la DNA polimerasi I dei batteri, posseggono anche attività esonucleasica, generalmente in direzione 3'→5', e grazie a questa proprietà possono correggere errori di appaiamento che si verificano durante la replicazione del DNA