La Coppa Italia di Serie B 2000-2001 è stata la 3ª edizione della manifestazione riservata alle società di calcio a 5 iscritte al campionato di Serie B. Si è svolta dal 23 settembre 2000 e al 18 marzo 2001.
Le 72 società iscritte al campionato di serie B sono state divise secondo il criterio di vicinorietà in 8 triangolari e 24 accoppiamenti. Nella prima fase, le società coinvolte nei triangolari si affrontano reciprocamente tra loro in un unico incontro; si qualifica al turno successivo la squadra prima classificata. Negli accoppiamenti, così come nelle fasi successive, le società si affrontano in incontri a eliminazione diretta articolate in andata e ritorno, il cui ordine di svolgimento è stato stabilito per sorteggio. Risulta qualificata la squadra che nelle due partite di andata e ritorno, ha ottenuto il miglior punteggio, ovvero, a parità di punteggio, la squadra che ha realizzato il maggior numero di reti. In questa fase il meccanismo di passaggio del turno prevede incontri a eliminazione diretta al termine dei quali, qualora sussistesse la condizione di parità, si disputeranno due tempi supplementari, ed eventualmente i tiri di rigore per determinare la vincitrice.
Si qualificano al secondo turno le 32 vincenti di ogni triangolare o accoppiamento. La squadra che riposa nella prima giornata è stata determinata per sorteggio, così come la squadra che disputa la prima gara in trasferta; nella seconda giornata riposa la squadra che avrà vinto la prima gara o, in caso di parità, quella che avrà disputato la prima gara in trasferta; nella terza giornata si svolge la gara fra le due squadre che non si sono incontrate in precedenza. Per determinare la squadra vincente si tiene conto, nell'ordine: dei punti ottenuti negli incontri disputati; della migliore differenza reti; del maggior numero di reti segnate. Persistendo ulteriore parità o nella ipotesi di completa parità tra le tre squadre la vincente è determinata per sorteggio. Gli incontri dei triangolari sono in programma il 23 e 30 settembre e il 7 ottobre 2000.